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-80℃及液氮冻存外周血干细胞的基础及临床研究

时间:2018-06-12 09:51来源:班德液氮罐 作者:秩名 点击:

-80℃及液氮冻存外周血干细胞的基础及临床研究 气相液氮罐

摘要 目的:探讨非程控降温-80℃冰箱冻存自体外周血干细胞(APRSC)与程控降温液lu冻存APBSC对细胞生物学的影响,井对自体造血干细胞移植的效果进行比较,为非程控降温-80℃冰箱冻存APBSC在临床上的推广应用提供依据。方法:回顾性分析非程控降温-80℃冰箱冻存APBSC及群控降温液氮冻存APBSC对ANC、MNC、CD34+细胞以及CFU-GM回收率的影响,并对72例接受自体造血干细胞移植的血液系统恶性肿瘤病人的造血重建的速度进行了比较。结果:两种冻存方法的ANC、MNC、CD34+细胞及CFU。GM回收率的影响无显著差异,移植后造血重建的速度亦无显著差异。结论:非程控降温-80℃冰箱冻存APBSC是一种简便易行的冻存方法。在国内某些单位可以替代程控降温液氰冻存APRSC进行干细胞移植。

关键词 自体造血干细胞移植 造血干细胞(冻存) 恶性肿瘤

非程控降温-80℃冰箱冻存自体外周血千细胞(APBSC)因其简便易行。在国内上E在不断地推广,我科自1988年开展程控降温液氨冻存APBSC进行干细胞移植及非程控降温-80℃冰箱冻存自体外周血干细胞移植以来,共完成了72例。现将两种冻存自体外周血干细胞移植结果总结如下。但禹内尚缺乏对二者的系统比较研究。我们试图通过系统比较二者的区别。观察非程控降温-80℃冰箱冻存APBSC进行干细胞移植的有效性和可行性。

病例和方法

1.1病例液氮凉存组36例,男性19例,女性L7例。平均年龄26。2(4—47)岁。急性髓细胞白血病(AWL)儿例,急性淋巴细胞白血病(ALL)12例。非霍奇金淋巴瘤(NHL)6例,骨髓增生异常综合征(iWI)S)RAEBT 3例,霍奇金淋巴瘤(1-11))l倒,粒淋混合急性白血病2例,多发性骨髓瘤(删)l例。-80℃冰箱冻存组36例,男23例。女13例,平均年龄25。4(5—50)岁。急性髓细胞白血稍(A虬)7倒,急性淋巴细胞白血稿(从L)13例。非霍奇金淋巴瘤(NltL)11例。骨髓增生异常综台征(MDS)RAEBT l例。霍奇金淋巴瘤(1iD)2例。粒淋混合急性自血病l例。乳腺癌l例,神经母细胞瘤l例。

1.2 APBSC动员[21 全部病例均采用化疗+刺激因子进行动员。方法为强化化疗后9。10大+WBC确已F降至zui低值(一般在2。0X10’,L以F),并开始有回升的趋势,同时PLT不低于20X109几时,使用造血刺激园子,利罱为150p∥12b。皮F注射。至采集结求。动员天数,液氮冻存组,平均5犬(4—7犬):一80℃冰箱冻存组,平均4。5天(3-6天)。

1.3 APBSC采集当w13c恢复至4.0—10。0X 10 9/L时开始采集,液氮冻存组均用Bxter公司的CS一3000型血细胞分离机进行分离采集;-80℃冰箱冻存组均用COBE公司的Spectra型血细胞分离机进行分离采集。通过股静脉插管(12F般腔Arrow公司)或通过救臂外周静脉建立外周通道。每次循环血量中位数为8000ml(5000—13000m1)。采集时分血流速平均50m1/分。两组采集的有核细胞数(Nc)、单个核细胞数(M№)、CD。CFU。GM的数量见表。。台盼蓝拒染率均为100%。

I.4 APBSC冻存两组采集的APBSC悬液,平均每次约60m1。加少许肝素。计算单个核细胞(眦)数,加入R蹦r1640保养液,按l:1比例与冷冻保护液均匀混合。-80℃冰箱冻存组使保护液终浓度为5%二甲基强砜(删S0),6%羟乙基淀粉(HES),螂白蛋白(ALB),llNC含量为2—5x 10 8/ml。将所得混合液装于冷冻袋中。直接置于-80X]冰箱中冻存。液lu组保护液终浓度为5%1圳S0,经卜3℃/分程控降温至-80℃后置-196℃液氮中保存。冻存大数,液氮冻存组,中付数22.5(13—50)天。-80℃冰箱冻存组,中位数23(15-44)天。

1.5预处理方案两组病人的预处理方案相似,即AML、ALL、MDS及NHL均用CAT或CET.C:CTX 60mg/kg/d×2天,A:Ara—c卜39/d×l天.E:vPl6 300-1000 mg/d×l天,中位剂量600mg/d.TBI总量zui低6Gy,zui高8.5(毗分两天,剂量率<5.0rad/min。预处理结束后24小时回输APBSC。

l.6 APBSC的解冻:将冻存袋自-80℃冰箱中或液氮中取出后立即放入40℃水浴箱中讯速解冻,不过滤,经中心静脉插管讯速回输。

结果

2.1 冻存前后APBSC的细胞数及回收率见表1。

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2.2移植后造血功能重建见表2~表3。

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2.3生存期及复发率液氮冻存组无病生存期40个月,复发率30。8%(1l例)。-80℃冻存组无病生存期39个月,复发率28%(10例)。移植后随访液氮冻存组共死亡ll例。-80℃冻存组共死亡6例。

讨论

APBSCT采集后不能立即回输。需冻存至少l周时间,或更长时间。冻存的目的是停止细胞代谢保持细胞活力,液氮(-196℃)温度低,酶活性被完全阻断,但由于这种方法设备昂贵、程序复杂而难于普及。1985年SZill等口l\”1报道用6%细胞外冷冻防护剂羟乙基淀粉(1iES)和5%二甲基亚砜(DMS0)作为PBSC的冷冻访护剂,不经程控降温直接在-80"C冰箱中保存的方法,两种冻存方法的NC、MNC、CD34、CFU—GM的回收率相拟I¨l,移植后造血重建(自细胞及血小板的恢复)时间也无差异t“1,本研究从来自两个组的冻存结果来看与其所报道结果一致。但由于。80℃冰箱的冻存方法开展时问短,尚缺乏大样本病例对比研究。我们试图通过大样本病例的对比研究,以期能得到更为全面准确的数据,为今后普及。80℃冰箱冻存APBSC进行移植治疗恶性肿瘤病人而提供更可靠的依据。研究结果显示二者所冻存细胞的Nc、刖c、CD34+细胞、CFU-GM的回收率及移植后造血功能重建均无显著差异。移植后随访液氮冻存组共死亡15例,一80℃冻存组共死亡12例,均为复发后死亡。液氮冻存组无病生存期及复发率与一80"C冻存组无病生存期及复发率相仿。

1962年Goodman等实验证实鼠、狗、猿等哺乳动物和人的外周血循环中存在造血干细胞。但在正常生理条件下。数量极少,正常人和疾病稳定期患者外周血中CD34+细胞数量为0。1-0。2%,只有骨髓中CD34+细胞数量的1-10*/d41,不能满足临床移植的需要。

经化疗药物和戚造血刺激因子可从骨髓中动员出大量造血干细胞唧,目前常用的化疗药物有环磷酰胺(CY)、足叶乙甙(VPl6)、顺铂等可增加血液中CFU。GM产量的6,5—13。3倍。细胞生长因子如G-CSF、GM。CSF等可增加外周血中CFU。GM达4-8倍。而化疗药和细胞生长因子联台应用效果更佳№’”,且动员的CD34+细胞具有更高分化潜能。本研究中,AML及MDS多用HAE方案,ALL多用MOEP方案,粒淋混合AL多用MOEP或HAE方案,NHL、HD多用MOEP或单用大剂量CTX(4。0)作为动员化疗方案。既能起动员作用,又能起巩固治疗作用。

干细胞采集时间和采集量是移植能否成功的重要环节。经动员化疗后,患者平均第6_7天WBC降至虽低,给予G-CSF 300 u g/d后患者外周血MNC迅速回升。杨勃彦等曾分别测定给G-CSF后MNC和CD34+、1by。1+细胞的变化,经统计平均注射G.CSF后第6-8天外周血CD34+细胞峰值,为采集zui佳时间。个别患者MNC上升过快或过缓,则需测定CD34+细胞以协助决定干细胞采集时间。干细胞采集量个体差异较大,采集范围MNC为(2.3—7.55)×105,kg,CD34+细胞为(2.22。9.56)×106/kg,平均6。34×106/kg,经冻存,回输时活细胞百分率平均>65%。非程控降温-80"C冰箱保存APBSC的方法可靠、简便,为APBSET的推广应用创造了便利条件。

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