超低温保存的注意事项及面临的挑战

冰冻和解冻对大多数细胞都是严重的胁迫，通过控制冷冻和解冻的速度以及改变细胞和细胞质的化学环境来改变。冰冻配子和胚胎在人类生育管理上的越来越重要。如下报告将解析超低温保存的注意事项及面临的挑战：自增压液氮罐

　　在冰冻过程中，主要的胁迫来自：①暴露在低温下;②冰晶的机械、物理效应;③胞外溶液性质的改变;④胞内溶液类似性质的改变。超低温损伤的一个原因，可能是细胞本身没有结冰时温度下降对细胞结构和功能的影响。若发生这种直接的低温损伤，则在降温过程中会很快地表现出来并取决于冷冻速度，随冷冻速度增加而增加。这种损伤在很多细胞包括细菌、酵母、原生生物、藻类、高等植物和哺乳类细胞系中都可观察到。

　　在水溶液环境的细胞系统中，冷冻速度慢将导致胞外结冰，而细胞仍未结冰，不过已处于超冷却状态(即处于溶液冰点以下，但无冰晶形成)。胞外结冰的主要后果是溶质从冰晶中排出，并在剩余的液体部分积累。这小部分溶液很快积累大量溶质，因而对细胞造成了高渗环境，以致未结冰细胞的渗透胁迫也就增加 (图1)。细胞的反应表现为失水、体积减少，并且因细胞膜的表面积减少可能遭受一系列机械损伤。这些损伤包括由于细胞收缩引起质膜物质丢失，这可能导致解冻过程中随着细胞恢复其原来的体积而发生胞溶作用。显然，在这种低温脱水过程中，未冰冻细胞的细胞质将更加浓缩，其细胞器将和整体细胞一样遭受后面损伤性的渗透胁迫效应。细胞外的冰晶和未结冰溶液将同时存在，直至达到溶液的共溶温度，在这种温度下，溶质开始晶体化。

　　图1 不同零下温度下未结冰水的百分数和未结冰NaCl溶液中溶质的摩尔数;

　　起初NaCl摩尔数为0.15M(引自Grout和Morris，1987)

　　超低温保存技术将面临的挑战：

　　1、要尽可能改进技术线路，以便发展中国家可以立即在农作物的保存和改良、以及生物技术和医疗保健的开发上获得益处。实现这一目标的重要步骤，就是发展和生产在技术不可靠的条件下性能可靠的廉价冰冻设备。第二步目标是大器官(例如肾)的超低温保存，以方便移植手术的器官供应。这里面的困难包括寻找适合保存大器官时不可避免的热传递问题。

　　2、用单一方案保存多种类型的细胞不是不能实现，这在生长后期的软体动物幼体保存中已被证实。这些动物直径在0.5mm以上，并具有发达的功能肌肉、带消化组织的内脏、活跃的纤毛和神经、循环组织。由于这些幼体体积小，表面积/体积较大，热传递可能不会受到很大的限制。不过，在更大的器官中例如哺乳动物的肾，传递关系很复杂，可能成为冷冻和脱水的重要限制因子。这些物理问题可能比细胞的多样性、对超低温保存的成功造成更大的影响。自增压液氮罐

　　超低温保存应用：

　　已证明液氮保存适应于一系列细胞、组织和有机体(例如细菌、酵母、血红细胞、杂交瘤、哺乳动物配子和高等植物培养细胞)，并且已成功地开发其商业价值，特别是牛精子和胚胎，以及最近的软体动物幼体。