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气相液氮运输罐短期储存胚胎的可行性研究材料和方法（上）
时间:2019-05-21 13:32来源: 作者:班德液氮罐 点击:
次
1．1动物
B10A、C57BL／6、DBA／2、B6D2，均由中科院上海实验动物中心提供。雄鼠为8周龄、雌鼠为4周龄。另外胚胎移植受体使用lO周ICR雌鼠【SCXK(沪)2007．o005】。实验严格遵守SPF级标准要求[SYXK(沪)2007．0005】。自增压液氮罐
1．2主要仪器
MⅦXC47／11一lO型液相液氮罐，MⅥZ SC4／3V型气相液氮运输罐，Heraeus C02培养箱，NikonSMZ．10实体显微镜等。
1．3培养基的准备
[气相液氮运输罐短期储存胚胎的可行性研究材料和方法（上）]
体外受精液：HTF(表1)；胚胎冷冻液：DMsO(Si舀m D2650)DAP213(DMSO：A七etaITlide：P玎叩yleneglycol=2：1：3)；石蜡油：(Sigma M8410)。在体外授精前1 d，准备好精子获能和体外授精的培养液滴(200“1)，上面覆盖经胚胎测试过的石蜡油，放入37℃，5％Co：的培养箱里隔夜平衡。
1．4气相液氮运输罐的准备在使用前1 d先将液氮冲入气相液氮运输罐到罐体的一半，放置5 h，降低罐内温度。然后再将液氮充满，使液氮吸附剂充分吸附液氮，放置24 h后，将多余的液氮倒出后待用。
1．5体外授精
取4周龄的小鼠，在体外授精前3 d的20：oo，每只腹腔注射PMSG 5IU，48 h后，再每只腹腔注射hCG 5IU。注射hCG后约13 h处死小鼠，打开腹腔，迅速分离输卵管，在滤纸上除去血迹后放入培养皿的石蜡油中，用解剖针挑破输卵管膨大部，卵子自然流出，用解剖针将卵子团引入到隔夜平衡的200 m H1F受精液滴中。在雌鼠注射hCG约12 h后用颈椎脱臼的方法处死雄鼠，打开腹腔，迅速分离附睾尾和输精管，尽可能除去黏附在附睾尾的脂肪和血迹。用手指捏住附睾尾，用眼科剪在其上部切开，用解剖针挑取精子放入隔夜平衡的200 ulHTF受精液滴里，培养1～1．5 h。将培养l h的精子悬浮液在显微镜‘卜．观察活力和数量后，每个受精液滴加入10 L‘l获能的精子。第二天早上洗卵，对2．细胞的胚胎进行计数。自增压液氮罐
B10A、C57BL／6、DBA／2、B6D2，均由中科院上海实验动物中心提供。雄鼠为8周龄、雌鼠为4周龄。另外胚胎移植受体使用lO周ICR雌鼠【SCXK(沪)2007．o005】。实验严格遵守SPF级标准要求[SYXK(沪)2007．0005】。自增压液氮罐
1．2主要仪器
MⅦXC47／11一lO型液相液氮罐，MⅥZ SC4／3V型气相液氮运输罐，Heraeus C02培养箱，NikonSMZ．10实体显微镜等。
1．3培养基的准备
[气相液氮运输罐短期储存胚胎的可行性研究材料和方法（上）]
体外受精液：HTF(表1)；胚胎冷冻液：DMsO(Si舀m D2650)DAP213(DMSO：A七etaITlide：P玎叩yleneglycol=2：1：3)；石蜡油：(Sigma M8410)。在体外授精前1 d，准备好精子获能和体外授精的培养液滴(200“1)，上面覆盖经胚胎测试过的石蜡油，放入37℃，5％Co：的培养箱里隔夜平衡。
1．4气相液氮运输罐的准备在使用前1 d先将液氮冲入气相液氮运输罐到罐体的一半，放置5 h，降低罐内温度。然后再将液氮充满，使液氮吸附剂充分吸附液氮，放置24 h后，将多余的液氮倒出后待用。
1．5体外授精
取4周龄的小鼠，在体外授精前3 d的20：oo，每只腹腔注射PMSG 5IU，48 h后，再每只腹腔注射hCG 5IU。注射hCG后约13 h处死小鼠，打开腹腔，迅速分离输卵管，在滤纸上除去血迹后放入培养皿的石蜡油中，用解剖针挑破输卵管膨大部，卵子自然流出，用解剖针将卵子团引入到隔夜平衡的200 m H1F受精液滴中。在雌鼠注射hCG约12 h后用颈椎脱臼的方法处死雄鼠，打开腹腔，迅速分离附睾尾和输精管，尽可能除去黏附在附睾尾的脂肪和血迹。用手指捏住附睾尾，用眼科剪在其上部切开，用解剖针挑取精子放入隔夜平衡的200 ulHTF受精液滴里，培养1～1．5 h。将培养l h的精子悬浮液在显微镜‘卜．观察活力和数量后，每个受精液滴加入10 L‘l获能的精子。第二天早上洗卵，对2．细胞的胚胎进行计数。自增压液氮罐
