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工业微生物菌种的保藏方法

时间:2019-05-17 10:15来源:未知 作者:班德液氮罐 点击:
菌种是一个国家的重要自然资源, 菌种保藏工 作是一项重要的微生物学基础工作, 菌种保藏工作者的任务是把从自然界分离得到的野生型或经人工 选育得到的用于科学研究和工业生产等方面的优菌种 、 菌株,用各种适宜的方法妥善保存, 使之达到 不死、 不衰 不变异 、 不污染,在长时间内保持原有的生产性状和生命活力,以便于科学研究和生产使用。 自增压液氮罐 

1  微生物菌种保藏的基本原理  
人们在长时间的工作实践中, 根据微生物的不 无论何种保藏方法,主要是根据微生物生理 、 生化特同要求,在菌种保藏工作中不断摸索出各种方法。  

2      保藏菌种用培养基  
为了有效地保藏微生物菌种, 首先需要有良好的培养基。因此, 研究选用适宜的培养基是微生物 菌种保藏最基本的工作。例如,ATCC (美国的一个 微生物菌种保藏机构) 在 1970 年以前采用的培养基 有 498 种,1974 年有 724 种,1978 年达到 1006 种,平 均每年增加 60 多种。  

3  微生物菌种的保藏方法  
将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上, 待菌 充分生长后,棉塞部分用油纸包扎好, 移至 4 ~ 6 ℃ 的冰箱中保藏。 保藏时间依微生物的种类而有不同,霉菌 、 放线 菌及有芽孢的细菌保存 2~4 个月,移种一次。酵母 菌两个月,细菌最好每月移种一次。斜面菌种应保 藏相继三代培养物以便对照, 防止因意外和污染造 成损失。 此法的培养时间和培养温度影响其保藏质量。 培养时间过短,保存时容易死亡, 培养时间长, 生产 性能衰退。一般以稍低于生长最适温度培养至菌种 成熟进行保藏,效果较好 [6 ]。 此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法, 优 点是操作简单,使用方便, 不需特殊设备, 能随时检 查所保藏的菌株是否死亡 、 变异与污染杂菌等。缺 点是容易变异,因为培养基的物理 、 化学特性不是严 格恒定的,屡次传代会使微生物的代谢改变,而影响 微生物的性状 ; 污染杂菌的机会亦较多。  

液体石蜡保藏法

亦称矿物油保藏法, 定期移植保藏法的辅助方 法。
(1) 液体石蜡的准备 : 选用优质化学纯液体石 蜡,将液体石蜡分装加塞, 用牛皮纸包好, 采用以下 两种方式进行灭菌 : ①
121 ℃湿热灭菌 30 min, 置 40 ℃ 恒温箱中蒸发水分, 经无菌检查后备用。 ② 160 ℃ 干热灭菌 2 h,冷却后,经无菌检查后备用。
(2) 斜面培养物的制备 : 将需要保藏的菌种, 在 最适宜的斜面培养基中培养, 使得到健壮的菌体或 孢子。
(3) 灌注石蜡 : 用灭菌吸管吸取灭菌的液体石 蜡,注入已长好菌的斜面上,其用量以高出斜面顶端1 cm 为准,使菌种与空气隔绝。
(4) 保藏 : 将试管直立,置低温 (4~6 ℃ 干燥处 ) 或室温下保存 (有的微生物在室温下比冰箱中保存保藏 2 年以上不死, 酵母菌可保藏 1 ~ 2 年, 一般无 芽孢细菌也可保藏 1 年左右, 甚至用一般方法很难 保藏的脑膜炎球菌, 在 37 ℃ 温箱内, 亦可保藏 3 个 月之久。此法的优点是制作简单,不需特殊设备,且 不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置, 所占 位置较大,同时也不便携带。从液体石蜡下面取培 养物移种后,接种环在火焰上烧灼时,培养物容易与 残留的液体石蜡一起飞溅,应特别注意。

滤纸保藏法
(1) 将滤纸剪成 0. 5 cm × 2 cm 的小条, 装入 1.0. 6 cm × cm 的安瓿管中,每管 1~2 张,塞以棉塞, 8 121 ℃ 灭菌 30 min。
(2) 需要保存的菌种,在适宜的斜面培养基上培养,使充分生长。 (3) 灭菌脱脂牛乳 1 ~ 2 mL 滴加在灭菌培养皿 或试管内,取数环菌苔在牛乳内混匀,制成浓悬液。
(4) 用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液 内,使其吸饱,再放回至安瓿管中,塞上棉塞。
(5) 将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的 干燥器中,用真空泵抽气至干。
(6) 将棉花塞入管内, 用火焰熔封管口, 保存于 低温下。
(7) 需要使用菌种, 复活培养时, 可将安瓿管口 在火焰上烧热,滴一滴冷水在烧热的部位,使玻璃破 裂,再用镊子敲掉口端的玻璃, 待安瓿管开启后, 取 出滤纸,放入液体培养基内,置温箱中培养。 细菌 、 酵母菌 、 丝状真菌均可用此法保藏, 前两 者可保藏 2 年左右, 有些丝状真菌甚至可保藏 14 ~ 17 年之久。此法较液氮 、 冷冻干燥法简便, 不需要 特殊设备。  

沙土保藏法
(1) 取河沙加入 10 %稀盐酸, 加热煮沸 30 min,以去除其中的有机质。
(2) 倒去酸水,用自来水冲洗至中性。
(3) 烘干,用 40 目筛子过筛, 以去掉粗颗粒, 备 用
(4) 另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红的时间还要长 )。保藏时间 2 ~ 10 年。保藏期间应 定期检查,如培养基露出液面,应及时补充无菌的液 体石蜡。
(5) 恢复培养 : 恢复培养时, 挑取少量菌体转接 在适宜的新鲜培养基上,生长繁殖后,再重新转接一 次。 此法实用而效果好。霉菌 、 放线菌 、 芽孢细菌可土,加自来水浸泡洗涤数次,直至中性。
(5) 烘干,碾碎,通过 100 目筛子过筛, 以去除粗 颗粒。
(6) 按一份黄土 、 三份沙的比例 (或根据需要而 用其他比例, 甚至可全部用沙或全部用土 ) 掺合均 匀,装入 10 mm × mm 的小试管或安瓿管中,每管 100 装 1 g 左右,塞上棉塞,121 ℃ 湿热灭菌 30 min,烘干。
(7) 进行无菌检查,每 10 支沙土管抽一支,将沙土倒入肉汤培养基中,37 ℃ 培养 48 h,若仍有杂菌, 则需全部重新灭菌, 再作无菌试验, 直至证明无菌, 方可备用。
(8) 选择培养成熟的 (一般指孢子层生长丰满 的,营养细胞用此法效果不好 ) 优良菌种, 以无菌水 洗下,制成孢子悬液。
(9) 每支沙土管中加入约 0. 5 mL (一般以刚刚 使沙土润湿为宜) 孢子悬液,以接种针拌匀。
(10) 放入真空干燥器内,用真空泵抽干水分,抽 干时间越短越好,务使在 12 h 内抽干。
(11) 每 10 支抽取一支, 用接种环取出少数沙 粒,接种于斜面培养基上, 进行培养, 观察生长情况 和有无杂菌生长, 如出现杂菌或菌落数很少或根本 不长,则说明制作的沙土管有问题,尚须进一步抽样 检查。
(12) 若经检查没有问题,用火焰熔封管口,放冰 箱或室内干燥处保存。每半年检查一次活力和杂菌 情况。
(13) 需要使用菌种,复活培养时,取沙土少许移 入液体培养基内,置温箱中培养。


此法多用于能产生孢子的微生物如霉菌 、 放线 菌,因此在抗生素工业生产中应用最广, 效果亦好, 可保存 2 年左右,但应用于营养细胞效果不佳。  以上各法可根据实验室具体条件与需要选用, 最好是每株菌种都采用两种以上的保藏方法, 并根 据保藏菌种的保质期,每隔一定时间,进行入藏菌种 的复活检验和更新。自增压液氮罐

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