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分离猪胚胎多能干细胞方法

时间:2018-05-21 11:03来源:班德液氮罐 作者:秩名 点击:
胚胎干细胞从囊胚内细胞团分离得到,具有自我更新和分化为3个胚层和生殖细胞的潜能。猪胚胎分离培养体系会改变细胞核移植胚胎、孤雌胚胎和体内胚胎多能基因的表达,也会影响猪多能干细胞形成的效率和质量。自增压液氮罐

细胞培养:用于核移植供体的猪胎儿成纤维细胞从初生猪仔的耳部分离得到。细胞培养基为DMEM,15%胎牛血清,培养温度为37℃。使用0.25%(W/V)的胰蛋白酶消化,中和后离心200×g。将细胞重悬后并加入等量冻存液(40%DMEM,40%FBS和20%DMSO),贮存在液氮中。

卵母细胞的收集和准备:从屠宰场收集猪卵巢,保存在含有青/链霉素的生理盐水中,运输温度32~38℃,3h内运回实验室。采用抽吸法采集卵巢卵母细胞。抽取3~6mm卵泡中的卵母细胞置于15mL离心管中,37℃水浴静置数分钟,待卵母细胞沉降后,用洗卵液洗2遍,显微镜下挑取颗粒细胞层达3层以上的卵丘卵母细胞复合物,然后将COCs转入U型皿中培养42~44h,每孔加500μL成熟培养液,每孔放置50~70枚。

孤雌激活和胚胎培养:用电融合仪将成熟的卵母细胞进行电激活,将卵母细胞移至2mmol/L6D孵育2.5h。分别将卵母细胞转移到胚胎培养基G1、NCSU23和猪受精卵培养基,24h后记录卵裂率。3d后,将培养基G1中发育的胚胎移入囊胚培养基G2。再次培养3~4d后,统计囊胚个数并收集。

体细胞核移植胚胎培养:去除成熟卵母细胞第一极体,随后注入供体细胞。显微操作后,移入含10%FBS的M199培养基,在38.5℃,5%CO2条件下孵育0.5h,使用电融合仪进行激活处理,移入6D孵育2.5h后,将重组胚胎在NCSU23培养基中培养3d,随后替换NC-SU23继续培养3~5d,观察胚胎的发育。

体内胚胎的收集:从人工受精的母猪体内收集第7~8d的囊胚,所有方法参照Stokes等。每天监测母猪的发,将发日期作为0d,鉴定后的6、12和18h进行人工受精。从子宫冲洗胚胎时使用预热的含10%FBS的磷酸缓冲盐溶液。

从猪胚胎分离胚胎多能干细胞:将去除透明带的囊胚接种到丝裂 素C处理过的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上2~4d,囊胚内细胞团在3~5d后出现。待ICM大小适中时,用机械法分离细胞,重铺到新的饲养层上,并使用不同的猪胚胎干细胞培养基,胚胎多能干细胞克隆每5~7d使用机械法传代。自增压液氮罐

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