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超低温保藏液氮法
时间:2017-08-02 08:58来源: 作者:班德液氮罐 点击:
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液氮超低温保藏法是目前保存微生物菌种最可靠的方法，多数国家级菌种保藏单位都采用此法。
1、准备安培管
用于液氮保藏的安培管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安培管。安培管的大小通常使用75×10mm的安培瓶。
2、加保护剂与灭菌
保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安培管塞上棉塞，在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭菌15min;若保存霉菌菌丝体则需在安培管内预先加入保护剂，如10%的甘油蒸馏水溶液或10%二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌种块为限，而后再进行高压灭菌。
3、接入菌种
将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安培管;霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安培管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。
4、冻结
再将已封口的安培管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。
5、保藏
经冻结至-30℃ 的安培管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相为-150℃，液态氮为-196℃。
6、恢复培养
保藏的菌种需要用时，将安培管取出，立即放入38～40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。再打开安培管，将内容物移到适宜的培养基上培养。
此法除了适宜于一般微生物的保藏外，对于一些用冷冻干燥法都难以保藏的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞都可长期保藏，而且不易发生变异。缺点是需要特殊设备。
