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无细胞百日咳攻击菌的制备及液氮保存材料和方法

时间:2019-05-13 10:28来源:未知 作者:班德液氮罐 点击:
1、 材料   自增压液氮罐

1.1分装容器
冻存管:4306592.0ml corning incorporated,cor-ning,NY14831 Made in Mexico。

1.2保护剂及培养基
甘油:分析纯。
蛋白胨水、活性炭半综合培养基和改良包-姜羊血培养基,由长春生物制品研究所培养基室提供。

1.3菌种
百日咳攻击菌种株18323由中国药品生物制品检定所提供。

2、方法

2.1攻击菌的制备
2.1.1 菌种复苏及传代  将菌种在无菌条件下复苏、溶解、混匀、传到包$姜羊血培养基中,37℃培养72h,同时作纯菌试验。合格后传二代经37℃培养48h,用活性炭半综合培养基传三代、四代、五代、六代、七代、八代、九代,37℃培养24h。
2.1.2保护剂的制备  将甘油加入蛋白胨水中制成含10%甘油的蛋白胨水,混匀灭菌。
2.1.3 菌悬液的制备  将各代菌液分别刮入装有ph7.2缓冲生理氯化钠溶液的大试管中,制成菌悬液并混匀,同时作纯菌试验,测定菌液浓度。

2.2攻击菌的分装
将菌悬液用含10%甘油的蛋白胨水稀释至27亿/ml,分装于灭菌的冻存管中,每管1.5~1.8ml。

2.3攻击菌保存
为防止细胞急剧冷冻后在细胞内形成冰晶,降低存活率,所以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。然后迅速放入液氮保藏器内的-150℃气相中,最后浸入到-196℃液氮中。

2.4攻击菌的检定
2.4.1攻击菌复苏  将冻存管从液氮罐中取出立即放入38~40℃的水浴中进行急剧解冻,直到全部融化为止。

2.4.2攻击菌稀释  打开冻存管,将攻击菌用生理氯化钠溶液稀释成每稀释度含80000、8000、800、80和8个菌。

2.4.3攻击途径及剂量  每稀释度(0.03ml)脑腔攻击10只小鼠,每稀释度分别攻击80000个菌、8000个菌、800个菌、80个菌、8个菌。自增压液氮罐

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